Verbesserte fluoreszierende Aminosäuren für die Zellbildgebung

Darstellung der Proteinstruktur von grün fluoreszierendem Protein (ganz links) im Vergleich zu 伪-Synuclein (oben), zusammen mit der gentechnisch veränderten Aminosäure Acridonylaranin (Acd) und der natürlichen Aminosäure Tryptophan (Trp). Das eingefügte Bild (unten rechts) zeigt, wie mit dieser synthetischen fluoreszierenden Aminosäure das 伪-Synuclein-Protein in lebenden Zellen abgebildet werden kann. Bildnachweis: E.James Peterson

Eine neue Studie, die von Forschern des Penns E. James Peterson-Labors in Zusammenarbeit mit der Oregon State University und der University of Washington durchgeführt wurde, ist eine helle, langlebige, umweltsensible Eigenschaft, die Proteine ​​in lebenden Zellen manipuliert. Diese Aufgabe hilft Biologen, Proteine ​​leichter zu untersuchen und die Mechanismen komplexer neurologischer Erkrankungen zu verstehen. Die Ergebnisse wurden in . veröffentlicht Chemische Wissenschaft In zwei verwandten Studien veröffentlicht in eLife Wann Wissenschaftsbericht..

Petersson Labs ist seit langem daran interessiert, neue Methoden zur Markierung von Proteinen mit fluoreszierenden Tags zu entwickeln, insbesondere für Proteine ​​wie Tau und 伪-Synuclein, die mit Alzheimer- und Parkinson-Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Derzeit werden bestimmte Proteine ​​intrazellulär verfolgt, indem das Fluoreszenz-Tag-Favorit Grün fluoreszierendes Protein hinzugefügt wird Finden Sie ihre Position innerhalb der Zelle mit (GFP) und einem Mikroskop. Proteine ​​wie GFP sind jedoch so groß, dass es schwierig ist, kleine Proteine ​​wie 伪-Synuclein zu untersuchen, das etwa halb so groß ist wie GFP. Es gibt andere Plattformen mit kleineren Tags, die jedoch toxisch sind und nicht für Langzeitstudien an lebenden Zellen verwendet werden können.

Ein anderer von Petersson Labs verfolgter Ansatz besteht darin, fluoreszierende Versionen von Aminosäuren, die kleine einzelne Bestandteile von Proteinen sind, chemisch zu synthetisieren. Forscher können dann modifizierte Enzyme verwenden, die es ermöglichen, fluoreszierende Aminosäuren in Proteine ​​einzubauen, wenn diese in der Zelle hergestellt werden. Durch die Kodierung unseres Fluorophors als Aminosäure kann unser System ein markiertes Protein bereitstellen, das sich genau wie ein natives Protein verhält, sagt Peterson.

Zuvor war es dem Peterson Institute for International Economics möglich, der Bakteriensäure Amino hinzuzufügen. Obwohl sie in der Natur nicht in dem Protein Acridonylaranin (Acd) vorkommt, haben Studien zu menschlichen Erkrankungen es noch nicht ermöglicht, dass dieses System in relevanten Säugerzellen funktioniert . Derzeit ist er Hauptautor und PhD am Peterson Institute for International Economics mit Hilfe von Mitarbeitern der Oregon State University und der University of Washington. Die Studentin Chloe Jones konnte eine breite Palette von Techniken aus der synthetischen organischen Chemie, Molekularbiologie, Zellbiologie und Mikroskopie zusammenstellen, um Acd in Säugetierzellproteine ​​​​zu integrieren.

Zunächst führten die Forscher im Labor von Ryan Mer, einem führenden Unternehmen für die Erweiterung des genetischen Codes in Oregon, gerichtete evolutionäre Experimente an E. coli durch. Forscher können manipulierte Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Enzyme verwenden, um den Proteinsyntheseprozess zu „kapern“, indem sie einen Teil des genetischen Codes von E. coli neu zuweisen, den sie als Ort für das Einfügen von Acds angeben. Es ist fertig. Als nächstes bestimmten die Forscher das spezifische mutierte Synthetase-Enzym, das optimal für den Einbau von Acd in die Proteinstruktur war. Sie führten auch Computermodelle durch, um zu verstehen, warum bestimmte Mutationen dies möglich machten.

Nach der Verbesserung der Art und Weise, wie Acd in E. coli-Proteine ​​eingebaut wurde, verließen sich die Forscher auf die Expertise von William Zagotta und Sharona Gordon von der University of Washington, die Erfahrung mit der Zugabe von unnatürlichen Aminosäuren zu Säugetieren hatten. cellSpeziell für Ionenkanalproteine ​​in Nervenzellen.

Unter ihnen Chemische Wissenschaft Laut der Abhandlung haben Forscher herausgefunden, dass Acd „besser ist als jede unnatürliche Aminosäure, die jemals verwendet wurde“, sagt Peterson. Im Vergleich zu anderen fluoreszierenden Aminosäuren ist Acd photostabiler, sodass sich die Fluoreszenz auch in Langzeitexperimenten nicht verschlechtert. Außerdem hat sie eine hohe Quantenausbeute und leuchtet heller als andere Sonden.

Außerdem hat Acd eine lange Fluoreszenzlebensdauer und ist ein Maß für die Verzögerung zwischen Lichtabsorption und Lichteintritt. Die Tatsache, dass es eine lange Lebensdauer hat, ermöglicht es uns, Veränderungen in der Umgebung zu sehen, in der Acd auftritt. Zum Beispiel können wir sehen, wann Acd mit anderen Proteinen komplexiert und wann es sich in der Nähe der Zellmembran befindet. „Petersson sagt.

In eLife Eine von Zagotta und Gordon geleitete Studie zeigte, dass Acd mit einer Metallionensonde kombiniert werden kann, um den Abstand zu messen, über den ein Protein seine Form ändert. Wissenschaftler haben diese Methode bereits mit anderen fluoreszierenden Aminosäuren verwendet, fanden jedoch heraus, dass Acd aufgrund seiner langen Fluoreszenzlebensdauer ein ausgezeichneter Fluoreszenzspender ist. Dieser neue Ansatz unter Verwendung von Acd wird verwendet, um strukturelle Veränderungen zu untersuchen, die für die Fähigkeit dieser Kanäle, die elektrische Aktivität von Neuronen zu regulieren, wesentlich sind.

In Wissenschaftsbericht In dem Artikel entwickeln Mitglieder des Peterson Institute Algorithmen, die Computermodellierung und maschinelles Lernen von Proteinstrukturen verwenden, um geeignete Orte für die acd-Platzierung vorherzusagen, und markierte Proteine ​​verhalten sich wie native Proteine. Ich habs geschafft. Der Ansatz des maschinellen Lernens hat die Barrieren überwunden, die bei früheren Versuchen zur Vorhersage der Acd-Toleranz auftraten.

Jetzt nutzt Peterson Labs dieses neue Verständnis der Maschinen, die für die Integration von Acd erforderlich sind, und erweitert es von seinem derzeit blau leuchtenden System auf grüne, gelbe und rote Sonden in zusätzlichen Farben. Herstellung manipulierter fluoreszierender Aminosäuren. Dies ermöglicht es Forschern, mehr Proteintypen innerhalb einer einzelnen Zelle zu verfolgen, ohne dass sperrige Zusätze erforderlich sind. Protein-Tags wie GFP.

Diese Studie ist auch ein wichtiger Meilenstein für die laufende Forschung im Peterson-Labor, das die zugrunde liegenden Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen wie Parkinson und Alzheimer untersucht. „Die Möglichkeit, diese fluoreszierenden Aminosäuren zu verwenden, um Proteine, die an diesen Krankheiten beteiligt sind, in einem Zellmodell zu markieren, ist sehr nützlich, um nach Veränderungen des Zellzustands zu suchen, da diese Proteine ​​einem toxischen Aggregationsprozess unterliegen. Es hilft, bis es in diesen neurodegenerativen Krankheitssituationen eingesetzt werden kann“, sagt Peterson.


Computergestütztes Proteindesign verwendet unnatürliche Aminosäuren


Für mehr Informationen:
Chloe M. Jones et al., Genetische Kodierung hoch photostabiler, langlebiger fluoreszierender Aminosäuren für die Bildgebung in Säugerzellen, Chemische Wissenschaft (2021). DOI: 10.1039 / D1SC01914G

William N Zagotta et al., eine verbesserte nicht fluoreszierende Nicht-Standard-Aminosäure zur Messung von Konformationsverteilungen unter Verwendung des zeitaufgelösten Übergangsmetallions FRET, eLife (2021). DOI: 10.7554 / eLife.70236

Sam Giannakoulias et al., ein auf Biomolekülsimulation basierendes maschinelles Lernmodell, sagt genau die Stelle der Resistenz gegen die unnatürliche Aminosäure Acridonylaranin voraus. Wissenschaftsbericht (2021). DOI: 10.1038 / s41598-021-97965-2

Zur Verfügung gestellt von
Universität von Pennsylvania

Zitieren: Https: //phys.org/news/2021-10-fluorescent-amino-acids-cellular-imaging.html Verbesserte fluoreszierende Aminosäuren für die Zellbildgebung Erhalten am 13. Oktober 2021 (10. 2021) 13. März)

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